原理:显微镜如何“看到”新型冠状病毒

引言

17世纪列文虎克第一次看到活细胞以来,显微成像技术就成了生物学领域的重要工具。

原理:显微镜如何“看到”新型冠状病毒

橙色圆球就是这次的新冠病毒

从组织、细胞、细胞器再到胞内的蛋白,人类在科学的道路上求索依旧,对显微技术的要求也越来愈高。

可惜,通过简单地磨制镜片制作出的光学显微镜已经不能满足需求,科学家们“看到”新型冠状病毒(后文称COVID-19)的工具也不是光学显微镜。

本文将先说明光学显微镜的困局,再介绍两种能看到COVID-19的显微镜。

光学显微镜

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黄色的是光路

从光源出来的光“携带”样品信息通过透镜和小孔,光在这些地方会发生衍射

比如经过小孔时,一束平行光应被视为一列密集的点光源(下图单缝处),点光源发出的球面波相互叠加后会出现明暗交替的同心圆环(艾里斑,下图右上)。

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这个过程类似水波经过狭小的缝隙,体现了光的波动性。

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水波的双缝衍射

如果我们想在显微镜下认出COVID-19,一束光不够。至少我们要看到病毒和周围环境的界面。

假如COVID-19和旁边的环境分别发出一束光,经过显微镜光路衍射后会形成两个艾里斑,如果它们离太近,那么就无法分辨病毒和环境的差异。

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原则上,对于包括光学显微镜的任何显微镜,COVID-19和环境的距离小到一定程度后就无法分辨。这个距离可以用阿贝公式进行数字化说明:

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想让显微镜能辨识更近的两点,就要缩小Δx。

考虑到照明光波长(λ)要处于人眼可辨范围(400-760nm),所以要让Δx最大,λ最小是400nm左右。

n是光路上介质的折射率,一般情况下空气n=1。另外,α是入射光角度,理想是90°,这个对于任何显微镜都一样,虽然永远也达不到这个理想情况。带进阿贝公式计算出,Δx最大值约为200nm。

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考虑到病毒直径在100nm左右,200nm的分辨率是肯定看不清的。

阿贝公式告诉我们,想减小Δx(增大分辨率),有两条路,一是把病毒到透镜间的介质折射率n减小,二是把光的波长减小。

最容易实现的就是把n减小,有一种显微技术叫“油浸物镜”。用折射率更大的油来作为传光介质,可以把n提高到1.4左右,所以,普通光学显微镜和油浸物镜的配合能把分辨率提到约150nm。

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这个分辨率还是远远不够,即便分辨率达到100nm,只能说勉强可以判断病毒两端的点,具体想看清病毒到底长啥样,分辨率不到5nm估计是想都不要想。

所以,要走不同于减小折射率的另一条路:用更短波长的“光源”。

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考虑到普通光学显微镜用的是光子,自然会想到能不能用短波长的光子来代替可见光,然后用传感器收集光信号代替人眼观察。

X射线波长够小,比如Cu-Kα射线可以达到0.15个nm,直接把可见光的400nm降了三个数量级,分辨率自然大幅提升。不过,这太理想化。

实际上,X射线的光源强度往往不够大,传感器根本测不到足够数据,而且X射线的光子难以聚焦,精密分析是天方夜谭。

有意思的是,从1895年伦琴用X射线拍摄各种物件开始,科学家就在绞尽脑汁想着用X射线当光源搭显微镜。

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左:伦琴妻子的手,右:伦琴

但是,直到它的竞争对手(本文主人公,拍COVID-19病毒的)拿了诺贝尔奖,X射线显微镜才算真正被做出来。这还得益于同步辐射光源、高性能检测器和Fresnel波带片的运用。

大活人还能让个尿给憋死了?X射线这条路走不通,当时的科学家干脆放弃用光子当“光源”!

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电子显微镜

既然要短波长“光源”,那么不如用电子。短波电子很容易获得,只需要给足够大的加速电压就行,动能上去后,根据德布罗意关系,波长就短了。

它们的波长甚至能达到0.1nm级别,电子显微镜的分辨率也可以达到几个nm,这下有足够分辨率观察病毒了。

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电子枪原理

相比汇聚光子,汇聚电子更轻松。类比光学的玻璃透镜,电子显微镜用的“透镜”是电磁透镜,原理也很简单,运动的电子会被磁场控制,磁场用通电线圈创造,大小和方向都可控。

另外,考虑到电子的粒子性强,需要在整个“光路”上保持真空环境,不然电子束流不集中。这点也比较容易实现。具体可见人造真空的科学:从澡堂拔火罐到芯片光刻机

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最后,这些电子和样品相互作用后会携带样品信息,用传感器采集放大信号,分析后就可以得出样品的模样。刚才那副打着问号的图其实就是一台电镜。

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短波长的电子表现出明显的粒子性,电子枪发出的电子经电磁透镜汇聚后打到样品上,这些电子和样品作用后有两条路:一是“原路返回”,二是“蛮横穿过”。两种原理分别对应着两种电镜。

扫描电子显微镜(SEM)

“原路返回”的电子主要有两种:背散射线子和二次电子。采集放大并分析这两种电子的信号,就是SEM的成像原理。

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背散射电子是指被固体样品原子反射回来的一部分入射电子,对样品的成分敏感,比如元素的种类。

次电子是指被入射电子轰击出来的核外电子,对样品表面形貌敏感,比如病毒和环境间的差异。

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这张图是最近发布的关于COVID-19的SEM照片,主要依靠的应该是二次电子信号,可以清晰看出病毒在背景上呼之欲出,很有立体感。

值得一提的是,这张SEM图是被修图后的。

据我所知,目前没有任何一种电子显微镜能够单独拍出彩色的图,因为传感器检测的主要是电子强度(数量)的信号,这就意味着只能在白和黑之间取个灰,不可能在白和黑之间取个红黄蓝绿。下图这种才是真实的SEM图像。

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还是黑白的看着顺眼嗷

透射电子显微镜(TEM)

除了“原路返回”的电子,还有直接透过样品的透射电子。

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考虑到有病毒的地方和没病毒的地方物质组成不一样,对入射电子的散射能力也各异。

比如重元素的原子核对电子散射能力强,透射电子过不去,图像偏暗。同样的元素,样品越“浓”,透射电子也不易穿过。这会形成质厚衬度

采集分析透射电子强度信号,就能实现成像。运用这种原理的电镜是TEM。

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这个也是PS后的

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冠状病毒看起来还是很可爱的

可以看出,相比采集二次电子的SEM,TEM的图像不具有立体感,这主要是因为后者采集的是透射电子,样品沿厚度方向被一视同仁。

无论10nm厚度处还是20nm,只要一个地方有足够多、足够重的原子把电子“遮住”,那这个区域在最终呈现的图像上就是暗的,比如病毒的蛋白质外壳。

当然也有部分原因是要想让透射电子够多,采集到足够的信号成像,样品太厚的话一团黑,所以必须把样品减薄到100nm以下,立体感在这个厚度下难以维系。

说到制样,不得不说SEM和TEM的制样是一门大学问,并不是提取病毒后马上就能拍摄的。

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比如会用到等离子体,给生物样品镀金膜

其中的部分操作和做分子料理很像,比如都会用到液氮、真空环境啥的,下篇文章简单聊聊,感兴趣的欢迎点个关注。

结语

"It is very easy to answer many fundamental biological questions; you just look at the thing!" —— 1965年诺贝尔物理学奖得主Richard Feynman

恐惧来源于未知,没什么比看到敌人更安心。从目力辨识,光学显微镜到能直接看到COVID-19的SEM和TEM,人类的历史是求索并创造的史诗。

对于病毒,我们已经有比前人更强大的武器,应该有充足的信心,平和而坚定地直面它们。

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